技術(shù)服務(wù)

服務(wù)步驟

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

交付結(jié)果

步驟1：

目的基因全基因合成

1.從GenBank中尋找目的蛋白的cDNA序列。 

2.根據(jù)選用的表達(dá)系統(tǒng)對(duì)cDNA進(jìn)行密碼子及mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的優(yōu)化。 

3.合成設(shè)計(jì)好的基因序列，并克隆到標(biāo)準(zhǔn)T載體。

1.含目的基因的凍干質(zhì)粒，穿刺菌及測序報(bào)告（如果客戶直接提供構(gòu)建好的質(zhì)粒，則免去這部分費(fèi)用）。

步驟2：

目的基因亞克隆

1.培養(yǎng)并抽提含有目的基因的載體質(zhì)粒。 

2.將目的基因亞克隆到合適的表達(dá)質(zhì)粒上。 

3.測序驗(yàn)證表達(dá)質(zhì)粒的準(zhǔn)確性。

正確構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒，含重組質(zhì)粒的DH5α菌株及測序報(bào)告。

步驟3：

E. coli 

表達(dá)菌株轉(zhuǎn)化及篩選

1.培養(yǎng)并抽提構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒。 

2.將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至高效的E. coli表達(dá)菌株中。 

3.至少挑選3個(gè)陽性克隆于LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增并誘導(dǎo)表達(dá)目標(biāo)蛋白。

4.SDS-PAGE電泳檢測培養(yǎng)后的目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況，并挑選合適的單克隆菌株用于目標(biāo)蛋白的表達(dá)。

重組質(zhì)粒的表達(dá)菌株及表達(dá)檢測報(bào)告。

步驟4：

目的蛋白表達(dá)及純化

1.搖瓶培養(yǎng)1L重組細(xì)菌，對(duì)蛋白表達(dá)時(shí)間，溫度以及IPTG濃度等表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，并誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。 

2.通過親和層析，離子交換，疏水及凝膠過濾等多種層析方法純化表達(dá)的重組蛋白。

3.利用蛋白酶去除不需要的純化標(biāo)簽，再純化獲得所需的目的蛋白。 

4.通過SDS-PAGE電泳檢測每步結(jié)果并控制最終產(chǎn)品質(zhì)量。 

5.通過Western-blot驗(yàn)證目的蛋白正確性。

1.純化好的目標(biāo)蛋白1-5mg及純化報(bào)告。

2.可按客戶要求提供含純化標(biāo)簽或去除純化標(biāo)簽的目的蛋白，純度最高可達(dá)95%以上。

3.提供QC報(bào)告：SDS-PAGE，Western Blot。

步驟5：

目的蛋白的再加工及詳細(xì)檢測

1.對(duì)生物學(xué)活性要求較高的純化后蛋白產(chǎn)品進(jìn)行復(fù)性研究。 

2.內(nèi)毒素去除，除菌，凍干等進(jìn)一步加工。 

3.通過HPLC，質(zhì)譜等方法詳細(xì)檢測目的蛋白的質(zhì)量

加工后的終產(chǎn)品及相關(guān)實(shí)驗(yàn)和檢測報(bào)告。