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中量大量細菌基因組DNA提取試劑盒(溶液型)

Midi Bacteria DNA Isolation Kit(Solution)

包裝規(guī)格：

一.產品介紹：
   本試劑盒用于快速的從各種細菌中提取基因組DNA。細菌樣品加入細胞核裂解液(或者通過溶菌酶或者其它一些酶幫助裂解細胞壁后)，首先在強去污劑作用下裂解細胞釋放出基因組DNA，接著加入RNase A去除RNA，然后蛋白沉淀液選擇性沉淀去除蛋白，最后純凈的基因組DNA通過異丙醇沉淀并重溶解于DNA溶解液。

三.產品特點：
1.不需要使用有毒的苯酚等試劑。
2.快速，簡捷，單個樣品操作一般可在30分鐘內完成。
3.結果穩(wěn)定，產量高，OD260/OD280典型的比值達1.7～1.9，長度可達50 kb -150kb，可直接用于構建文庫，PCR，Southern-blot和各種酶切反應。

四.適用范圍：
       適用于快速提取各種細菌基因組DNA。

五.儲存條件：
1.環(huán)境溫度低時細胞核裂解液中某些去污劑成份會析出出現渾濁或者沉淀，可在37℃水浴加熱幾分鐘，輕輕旋搖，即可恢復澄清，不要劇烈搖晃，以免形成過量的泡沫。
2.蛋白沉淀液可能出現析出和沉淀，可以在37℃水浴幾分鐘幫助重新溶解，如果不能完全溶解，也不影響使用效果，直接取用上層溶液即可。
3.避免試劑長時間暴露于空氣中產生揮發(fā)、氧化、pH值變化，各溶液使用后應及時蓋緊蓋子。

六.注意事項：
1.所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉速可以達到3,000xg，可容納50ml離心管的臺式離心機。
2.用戶需自備異丙醇、70％乙醇、0.5M EDTA和Lysozyme（溶菌酶）(用于革蘭氏陽性菌)、lysostaphin(用于某些難裂解的革蘭氏陽性菌)、水浴箱。
3.開始實驗前將需要的水浴先預熱好備用。
4.本試劑盒為溶液型，可以很容易的按照比例擴大或者縮小每次處理的細菌細胞量，請聯系我們索取其它處理量的操作手冊。

七.操作步驟：（實驗前請先閱讀注意事項）
1.收集10毫升過夜培養(yǎng)細菌加入15毫升離心管。

2.2,000xg離心3分鐘，使細胞沉淀下來，棄上清，渦旋或輕彈打散細胞沉淀。對革蘭氏陽性菌，接步驟3。對革蘭氏陰性菌，直接接步驟6。

3.加入4.8ml 50mM EDTA (PH 8.0) 完全重懸細胞。

4.加入1.2ml溶菌酶(20mg/ml)，混勻。
對于大部分的革蘭氏陽性菌如Bacillus subtilis，Micrococcus luteus，Arthrobacter luteus，Nocardia otitidiscaviarum，Rhodococcus rhodochrous和Brevibacterium albidium，使用溶菌酶就可以有效裂解。但是對于某些種類的Staphylococcus，則應該加入60μl溶菌酶(20mg/ml)和60μl lysostaphin (20mg/ml)確保有效裂解。

5.37℃溫育30-60分鐘。2,000xg離心10分鐘，棄上清, 吹打渦旋打散細胞沉淀。

6.加入9ml細胞核裂解液至打散的細胞，輕柔吹打裂解細胞。

7.80℃溫育5分鐘裂解細胞，然后冷卻至室溫。

8.加入18μl RNase A（10mg/ml）至裂解物中至終濃度20μg/ml。顛倒混勻后37℃溫育15-60分鐘去除殘留RNA。然后室溫冷卻至少5分鐘使回復到室溫。

9.在回復到室溫的裂解物內加入3ml蛋白沉淀液后，在渦旋振蕩器上高速連續(xù)振蕩混勻25秒?；靹蚝罂赡芤姷揭恍┬〉牡鞍讏F塊。冰浴5分鐘。
由于樣品體積重量小，用渦旋振蕩器振蕩混勻產生的剪切力并不會剪切打斷基因組DNA。如果用手振蕩混勻，則不可以用手上下劇烈振蕩混勻，只能適當力度振蕩混勻，否則會剪斷基因組DNA；但是力度也不能小，要保證充分混勻，將粘稠的裂解物打散開，否則DNA無法和蛋白質沉淀分離開，離心的時候會和蛋白質一起沉淀下來，造成DNA丟失或者降低產量。此外混勻不充分也可能造成蛋白沉淀不充分， 最后的產物污染有較大量的蛋白質。因此建議用渦旋振蕩器。

10.5,000xg(可根據需要調整加大離心力)離心10分鐘。這時應該可以見到管底蛋白沉淀，也可能見到一些蛋白沉淀漂浮在液體表面。

11.小心吸取上清到一個新的50ml離心管中。
吸取上清時小心不要吸到管底的和漂浮在液體表面的蛋白沉淀，如果不小心將蛋白沉淀轉入新的離心管中，可再次離心5分鐘后取上清。

12.加入等體積的室溫異丙醇（（約9ml），輕柔顛倒30次混勻或者直到出現棉絮狀（絲狀）白色DNA沉淀。
注意有時候棉絮狀（絲狀）DNA顛倒混勻的時候，粘附著在蓋子或者管口處，即使顛倒也不跟下來，這樣導致操作者看不到沉淀，誤認為沒有得到DNA。解決辦法是略去步驟13，直接2,000xg離心5分鐘，棄上清，然后接步驟15。

13.垂直放置離心管，讓白色DNA沉淀自然沉到管底，然后盡可能多的吸棄大部分的上清，注意不要吸到沉淀。

14.加入9ml 70％乙醇后，顛倒幾次漂洗DNA沉淀，2,000xg離心3-5分鐘，在管底可以見到白色的DNA沉淀塊，倒棄上清。

15.加入5ml 70％乙醇，顛倒幾次漂洗DNA沉淀，2,000xg離心1分鐘， 倒去上清（注意不要把DNA沉淀倒掉了），倒置后在吸水紙上輕敲幾下以控干殘留乙醇，還可以用槍頭小心吸掉管底沉淀周圍和管壁的殘留乙醇，空氣晾干沉淀幾分鐘。
注意不要干燥過頭，否則DNA極其難溶；也不能殘留太多乙醇，否則乙醇可能抑制下游如酶切反應。

16.加入500μl DNA溶解液重新水化溶解DNA沉淀，輕彈管壁混勻，可以放置在65℃溫育30-60分鐘（不要超過一小時），中間不時的輕彈管壁幫助重新水化DNA。也可以在室溫或者4℃放置過夜來重新水化DNA，中間不時顛倒輕彈幫助溶解。

17.DNA可以存放在2-8℃，如果要長時間存放，可以放置在－20℃。