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Allprep RNA/DNA/miRNA Extraction Kit(Column)

包裝規(guī)格：

一.產品介紹：
本試劑盒設計用于快速從同一個動物細胞或者組織樣品中同時提取分離基因組DNA和包括miRNA的總RNA。獨特的裂解液迅速裂解細胞和滅活細胞RNA/DNA酶，然后裂解混合物RNA/miRNA/ DNA同時通過一個基因組DNA吸附柱，基因組DNA被吸附而miRNA/RNA穿透濾過。DNA吸附柱上基因組DNA經過一系列漂洗-離心后洗脫得到純凈基因組DNA。濾過的miRNA/RNA用乙醇調節(jié)結合條件后，miRNA/RNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于miRNA/RNA吸附柱上， 再通過一系列快速的漂洗-離心洗脫得到純凈的miRNA/RNA。無苯酚、氯*DNA/RNA快速提取技術基礎上配合獨家的分離技術同時得到的miRNA/RNA/基因組DNA純度高，互不干擾。得到的miRNA/RNA不需要DNase消化，可直接用于反轉錄PCR、熒光定量PCR等實驗?；蚪MDNA也可以直接用于下游的Southern、酶切、PCR等各種試驗。

二.產品特點：
1.完全不使用有毒的苯酚，氯*等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。
2.快速，簡捷，單個樣品miRNA/RNA/基因組DNA分離操作一般可在40分鐘內完成。
3.獨家吸附柱和配方確保有效清除基因組DNA殘留，一般情況下得到的miRNA/RNA不需要DNase消化可直接用于反轉錄PCR、熒光定量PCR等實驗。
4.多次柱漂洗確保miRNA/RNA/基因組DNA高純度，可直接用于下游各種實驗。

三.適用范圍：
適用于快速從同一個動物細胞或者組織樣品中同時提取分離基因組DNA和包含miRNA的總RNA(如購買額外miRNA吸附柱子和配套溶液，還可以將同一個樣品的總RNA和miRNA分離并提取，富集miRNA。），不需要使用DNase消化，RNA可直接用于反轉錄PCR，熒光定量PCR.。

四.儲存條件：
1.所有的溶液應該是澄清的，如果環(huán)境溫度低時溶液可能形成沉淀，此時不應該直接使用，可在37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復澄清。
2.不合適的儲存于低溫（4℃或者－20℃）會造成溶液沉淀，影響使用效果，因此運輸和儲存均在室溫下（15℃－25℃）進行。
3.避免試劑長時間暴露于空氣中產生揮發(fā)、氧化、PH值變化，各溶液使用后應及時蓋緊蓋子。

五.注意事項：
1.所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉速可以達到13,000 rpm的傳統(tǒng)臺式離心機，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機。

2.樣品處理量絕對不要超過基因組吸附柱DA和和RNA吸附柱RA處理能力，否則造成DNA殘留或者產量降低。不同組織細胞種類RNA/DNA相差極大，例如胸腺脾臟DNA含量豐富，超過5mg就會超過柱子處理能力。COS細胞RNA含量豐富，超過3x106細胞就會超過柱子吸附能力。所以開始摸索實驗條件時，如果不清楚樣品DNA/RNA含量時寧可使用較少的樣品處理量，如細胞不超過3-4x106，組織不超過10mg。將來根據樣品試驗情況增加或者減少處理量。

3.裂解液RLT Plus 、抑制物去除液IR、Wash solution 1、Wash solution 2/3中含有刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。

4.該試劑盒如需要用于植物樣品尤其是多糖多酚次級代謝產物豐富的困難樣品的DNA/miRNA/RNA提取，請咨詢技術人員，可能需要用到其它試劑。

5.如購買額外miRNA吸附柱子和配套溶液，還可以將同一個樣品的總RNA和miRNA分離并提取，富集miRNA。請咨詢我們。

6.關于DNA 的微量殘留：
一般說來任何總RNA提取試劑在提取過程中無法完全避免DNA的微量殘留（DNase消化也無法做到100%無殘留），本公司的Allprep組織/細胞miRNA/RNA/DNA/分提試劑盒，由于采取了本公司獨特的緩沖體系和基因組DNA分離清除技術，絕大多數DNA已經被清除，不需要DNase消化，可直接用于反轉錄PCR和熒光定量PCR。個別特殊情況如DNA含量過于豐富造成殘留或者要進行嚴格的mRNA表達量分析熒光定量PCR，我們建議在進行模板和引物的選擇時：
 1)選用跨內含子的引物，以穿過mRNA中的連接區(qū)，這樣DNA就不能作為模板參與擴增反應。
 2)選擇基因組DNA和cDNA上擴增的產物大小不一樣的引物對。

六.操作步驟：（實驗前請先閱讀注意事項）
   提示：
         第一次使用前請先在漂洗液RW瓶、漂洗液WB和70%乙醇瓶中加入指定量無水乙醇!
1.組織培養(yǎng)細胞
 a.收集<107懸浮細胞到一個1.5ml離心管，對于貼壁細胞，孔板培養(yǎng)可以直接裂解，細胞瓶培養(yǎng)應該先用胰蛋白酶消化后吹打下來收集。

 b.13，000rpm離心10秒（或者300xg離心5分鐘），使細胞沉淀下來。完全吸棄上清，留下細胞團，注意不完全棄上清會稀釋裂解液導致產量純度降低。

 c.輕彈管壁將細胞沉淀完全松散重懸，加350μl（<5x106細胞）或600μl（5x106-1x107細胞）裂解液RLT Plus，吹打混勻后用手劇烈振蕩20秒充分裂解。

 d.勻漿：（處理細胞量極少時<1x105一般不需要，渦旋振蕩一分鐘勻漿）。用帶鈍針頭的一次性 1 ml(配0.9mm針頭) 注射器抽打裂解物 5-10 次或直到得到滿意勻漿結果(或者電動勻漿30秒) ，可     以剪切DNA，降低粘稠度防堵塞柱子和提高產量。

 e.將裂解混合物或勻漿混合物全部加到DNA吸附柱上（吸附柱放在收集管內）。

 f.接操作步驟項下3。

2.動物組織（例如鼠肝腦）
 a.電動勻漿：新鮮組織用解剖刀迅速切成小碎塊,加入350μl(<20mg組織)或者600μl(20-30mg組織)的裂解液RLT Plus 后電動徹底勻漿20-40秒。

 b.液氮研磨+勻漿：在液氮中研磨組織成細粉后，取適量組織細粉(20mg/30mg)轉入裝有350μl/600μl組織裂解液RLT Plus的1.5ml離心管中， 用手劇烈振蕩20秒，充分裂解。用帶鈍針頭的一次性 1     ml(配0.9mm針頭) 注射器抽打裂解物 10 次或直到得到滿意勻漿結果(或者電動勻漿30秒) ，可以剪切DNA，降低粘稠度防堵塞柱子和提高產量。

 c.將勻漿后裂解物13，000rpm離心3分鐘,沉淀可能存在的裂解困難的碎片或者不溶物，將裂解物上清全部加到DNA吸附柱上（吸附柱放在收集管內）。

 d.接操作步驟項下3。

3.13,000 rpm離心30秒，保留濾過液（miRNA/RNA在濾過液中）。DNA吸附柱子（膜上吸附有基因組DNA）短時間可存放4℃度備用。確保離心后液體全部濾過去，膜上沒有殘留，如有必要，可以加大離心力和離心時間。

以下步驟為提取RNA步驟：
4.用微量移液器較精確估計濾過液體積（350μl或者600μl左右，濾過時候損失體積應該減去），加入1.25倍體積的無水乙醇，此時可能出現沉淀，但是不影響提取過程，立即吹打混勻，不要離心。

5.立刻將混合物(每次小于700μl，多可以分兩次加入)加入一個RNA吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm離心30秒，棄掉廢液。裝濾過液體和乙醇混合物的DNA吸附柱的收集管（混合物轉入RNA吸附柱后剩下的空收集管）需要保留，將DNA吸附柱放回此收集管保留在4℃，備用于步驟11開始的基因組DNA提取。

6.加700μl Wash Solution 1（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。

7.加入500μl Wash Solution 2/3（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000 rpm 離心30秒，棄掉廢液。加入500μl Wash Solution 2/3，重復一遍。

8.將吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應。

9.取出吸附柱RA，放入一個RNase free離心管中，根據預期RNA產量在吸附膜的中間部位加30-50μl RNase free water， 室溫放置1分鐘，12,000 rpm 離心1分鐘。

10.如得到的RNA可以立即用于下游反應或者盡快置于低溫保存。

以下步驟為提取DNA步驟：
11.在步驟3的DNA吸附柱上加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm 離心30秒，棄廢液。

12.加入700μl漂洗液WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。

13.加入500μl漂洗液WB，12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。

14.將DNA吸附柱放回空收集管中，13,000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應。

15.取出DNA吸附柱，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加100μl洗脫緩沖液EB （洗脫緩沖液事先在65-70℃水浴中預熱效果更好）， 室溫放置3-5分鐘，12,000rpm 離心1分鐘。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鐘，12,000rpm離心1分鐘。

洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要DNA濃度較高，可以適當減少洗脫體積， 但最小體積不應少于50μl，體積過小降低DNA洗脫效率，減少DNA產量。

16.DNA可以存放在2-8℃，如果要長時間存放，可以放置在－20℃。

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